Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Гель обесцвечивают большим объемом обесцвечивающего раствора Р. Обесцвечивающий раствор меняют несколько раз до четкого проявления белковых полос на прозрачном фоне. Чем тщательнее обесцвечивают гель, тем меньшее количество белков можно найти этим методом. Обесцвечивание можно ускорить использованием нескольких граммов анионобменной смолы или маленькой губки, смоченной обесцвечивающим раствором Р.
ПРИМЕЧАНИЕ. Кислотно-спиртовые растворы, используемые в указанных методиках, не полностью фиксируют белки в геле. Это может привести к потерям некоторых низкомолекулярных белков в процессе окрашивания и обесцвечивания тонких гелей. Стойкая фиксация обеспечивается выдерживанием геля в смеси трихлоруксусная кислота Р - метанол Р - вода Р (1:4:5) в течение 1 часа перед погружением геля в раствор краски Кумасси Р.
Окрашивание серебром. Гель погружают в большой объем фиксирующего раствора Р и выдерживают продолжительностью 1 час. Фиксирующий раствор сливают, гель заливают свежим фиксирующим раствором и выдерживают продолжительностью не менее 1 часа и, если возможно, оставляют на ночь. Фиксирующий раствор сливают и гель промывают большим объемом воды Р в течение 1 ч. Затем гель выдерживают в растворе 1% (об/об) глутарового альдегида Р в течение 15 мин, дважды промывают большим объемом воды Р, каждый раз продолжительностью 15 минут, помещают в свежеприготовленный реактив серебра нитрата Р и выдерживают по 15 мин в темном месте. Затем трижды промывают большим объемом воды Р, каждый раз по 5 мин. Гель выдерживают в растворе проявителя Р около 1 минуты до достаточного окрашивания. Проявление останавливают, помещая гель в блокирующий растор Р на 15 мин. Ополаскивают гель водой Р.
ВЫСУШИВАНИЕ ОКРАШЕННЫХ ДСН-ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЕЙ
Гели высушивают в зависимости от использованного метода окрашивания. Кумасси-окрашенные гели после стадии обесцвечивания выдерживают в растворе 100 г/л глицерина Р в течение 2 ч (возможно инкубирование на ночь). При окрашивании серебром на конечной стадии ополаскивания выдерживают гель в растворе 20 г/л глицерина Р в течение 5 мин.
Два листа пористой целлюлозной пленки погружают в воду Р и выдерживают от 5 до 10 мин. Один из листов помещают на рамку высушивания, осторожно наносят на него гель, удаляют воздушные пузырьки и наносят несколько миллилитров воды Р по краям геля, накрывают другим листом, удаляют воздушные пузырьки и завершают сборку рамки высушивания. Рамку помещают в сушилку и оставляют при комнатной температуре до высушивания геля.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ
Молекулярную массу белков определяют, сравнивая их подвижность с известными белками известной молекулярной массой. Имеются заранее смешанные смеси белков с известными и разными интервалами молекулярных масс для равномерного окрашивания и калибрования гелей. Концентрированные растворы белков с известной молекулярной массой разводят соответствующим буферным раствором для образцов и наносят на тот же гель, что и испытуемый белок.
Сразу после проведения электрофореза определяют электрофоретический фронт красителя бромфенолового синего. Это можно сделать нанесением насечки на край геля или введением иголки, смоченной индигокармином на фронт красителя. После окрашивания измеряют расстояние миграции каждой белковой полосы (известных и неизвестных) от края разделительного геля. Расстояние передвижения каждого белка делят на расстояние, пройденное сопутствующим красителем. Полученные результаты передвижения называются относительной подвижностью белков (относительно фронта красителя) и условно обозначаются Rf. Строят график зависимости логарифма относительных молекулярных масс (М.м.) белковых стандартов от условно полученных значений Rf. Обычно график имеет слегка сигмовидную форму. Неизвестные молекулярные массы определяют методом линейной регрессии интерполяцией графика зависимости log М.м. от Rf., если значения, полученные для неизвестных образцов, располагаются на линейной части графика.
ВАЛИДАЦИЯ ИСПЫТАНИЯ
Результаты испытания признаются достоверными если молекулярные массы известных белков расположены вдоль 80% длины геля и по всей области необходимого деления (то есть, области, покрывающей образец и его димеры или образец и сопровождающие примеси), разделение соответствующих белковых полос проявляет линейную зависимость логарифма молекулярной массы от Rf. Дополнительные условия к валидации по отношению к испытуемым растворам указываются в частной статье.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСЕЙ
Если в частной статье указывают предел содержания примесей, в испытании необходимо использовать раствор сравнения соответствующего разведения. Например, если предел содержания примесей составляет 5%, необходимо использовать раствор сравнения, разведенный по отношению к испытуемому раствору в соотношении 1:20. На электрофореграмме испытуемого раствора ни одна примесь (ни одна полоса, кроме основной) не должна быть интенсивнее основной полосы на электрофореграмме раствора сравнения.
Для валидированной методики содержание примесей может определяться методом внутренней нормализации по отношению к основной полосе с использованием интегрирующего денситометра. При валидации методики необходимо подтвердить линейность сигнала.
